Un agoniste Nurr1 optimisé fournit des maladies | Chengdu CFilling Machine Group Co., Ltd

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 4283 (2023) Citer cet article

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Le récepteur nucléaire, Nurr1, est essentiel à la fois au développement et au maintien des neurones dopaminergiques du mésencéphale, représentant une cible moléculaire prometteuse pour la maladie de Parkinson (MP). Nous avons précédemment identifié trois agonistes de Nurr1 (amodiaquine, chloroquine et glafénine) qui partagent un échafaudage chimique identique, la 4-amino-7-chloroquinoline (4A7C), suggérant une relation structure-activité. Nous rapportons ici une recherche systématique en chimie médicinale dans laquelle plus de 570 dérivés 4A7C ont été générés et caractérisés. Plusieurs composés améliorent l'activité transcriptionnelle de Nurr1, conduisant à l'identification d'un agoniste optimisé pénétrant dans le cerveau, 4A7C-301, qui présente de robustes effets neuroprotecteurs in vitro. De plus, 4A7C-301 protège les neurones dopaminergiques du mésencéphale dans le modèle murin mâle de MPTP induit par le MPTP et améliore les déficits olfactifs moteurs et non moteurs sans comportements de type dyskinésie. De plus, le 4A7C-301 atténue de manière significative les anomalies neuropathologiques et améliore les dysfonctionnements moteurs et olfactifs dans les modèles de souris mâles surexprimant l'α-synucléine médiés par AAV2. Ces propriétés modificatrices de la maladie du 4A7C-301 peuvent justifier une évaluation clinique de ce composé ou de composés analogues pour le traitement des patients atteints de MP.

La maladie de Parkinson (MP), qui touche 2 à 3 % de la population âgée de plus de 65 ans, est la deuxième maladie neurodégénérative la plus courante, après la maladie d'Alzheimer1,2,3. La dégénérescence sélective des neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDAN) dans la substance noire et l'accumulation et l'agrégation neurotoxiques de l'α-synucléine (αSyn) dans les corps de Lewy sont des caractéristiques pathologiques caractéristiques de la MP. On pense que la manifestation de la MP est causée par l’action combinée de facteurs génétiques et environnementaux via de multiples voies d’interaction, notamment le dysfonctionnement mitochondrial, le stress oxydatif, la neuroinflammation et la dégradation/autophagie dérégulée des protéines3,4,5,6,7. Actuellement, la thérapie de remplacement de la dopamine (DA) (par exemple, L-DOPA) est le traitement de référence. Bien qu'il améliore considérablement la qualité de vie des patients parkinsoniens, la fenêtre thérapeutique sans effets secondaires inacceptables, tels que la dyskinésie, et le degré de bénéfice diminuent avec le temps8,9, et il n'existe aucun traitement capable d'arrêter ou de ralentir la progression de la maladie. Il existe donc un grand besoin non satisfait de développer un nouveau traitement de fond pour la PD10,11.

Au cours des dernières décennies, les cascades de régulation transcriptionnelle des mDAN ont été étudiées de manière approfondie12. Deux voies majeures de développement du mDAN (c'est-à-dire Sonic hedgehog-FoxA2 et Wnt1-Lmx1A) convergent pour induire Nurr113,14,15, mettant en évidence Nurr1 comme régulateur principal des mDAN. En effet, des études sur des souris Nurr1 knock-out (KO) et KO conditionnel ont démontré que Nurr1 est essentiel non seulement pour le développement16 mais également pour le maintien des mDAN adultes17. De plus, il a été démontré que Nurr1 protège les mDAN de la mort induite par la neuroinflammation en supprimant l’expression de gènes pro-inflammatoires neurotoxiques4. De plus, il a été rapporté que l’expression de Nurr1 était significativement diminuée dans le cerveau des patients âgés et sporadiques de la maladie de Parkinson18,19,20.

Nurr1 appartient à la sous-famille des récepteurs nucléaires NR4A, ce qui suggère que sa fonction de transcription peut être modulée par des ligands synthétiques et/ou endogènes21. De plus, Nurr1 peut fonctionner comme activateur transcriptionnel et comme répresseur, en fonction du contexte cellulaire (par exemple, dans mDANs16 et microglia4, respectivement). Pour commencer à déterminer si Nurr1 pourrait être une cible moléculaire pour le traitement modificateur de la maladie de PD22, nous avons établi des systèmes de test à haut débit et avons préalablement examiné une bibliothèque de médicaments approuvés par la FDA des États-Unis. Nous avons identifié trois médicaments, à savoir l'amodiaquine (AQ), la chloroquine (CQ) et la glafénine, qui améliorent considérablement l'activité transcriptionnelle de Nurr1 grâce à une liaison directe à son domaine de liaison au ligand (LBD) . Les trois médicaments partageaient un échafaudage chimique identique, à savoir. 4-amino-7-chloroquinoline (4A7C), nous incitant à émettre l'hypothèse que ce motif 4A7C représente une relation structure-activité (SAR) qui pourrait être utilisée pour identifier de meilleurs dérivés 4A7C avec une puissance plus élevée et des effets secondaires moindres grâce à des médicaments basés sur le SAR. chimie24. Conformément à cette hypothèse, des travaux récents de Munoz-Tello et al. 25 et Willems et coll. 26,27 ont montré qu'AQ et CQ et leurs dérivés peuvent fonctionner comme agonistes de Nurr1. Willems et coll. 26 ont également rapporté que l'élimination du groupe 7-chloro ou 4-amino du pharmacophore 4A7C entraîne une perte d'activité, confortant ainsi notre hypothèse selon laquelle 4A7C est un pharmacophore valide pour la conception de puissants agonistes de Nurr1. À cette fin, nous avons mené un effort systématique de chimie médicinale en utilisant la CQ comme composé de départ, car elle est relativement sûre et est encore largement utilisée pour traiter des maladies humaines telles que le paludisme et les maladies auto-immunes28. Nous avons caractérisé plusieurs (> 570) dérivés du 4A7C à l'aide d'analyses biochimiques, moléculaires et cellulaires et identifié un candidat final, le 4A7C-301, qui présente une puissance nettement plus élevée et fournit des effets neuroprotecteurs basés sur un mécanisme dans des modèles de MP in vitro et in vivo. , en utilisant séparément à la fois un modèle de facteur de risque environnemental (l'inhibiteur du complexe mitochondrial I 1-méthyl-4-phyénylpyridinium (MPP+)) et un modèle génétique (αSyn) de la MP. Contrairement à la L-DOPA ou au CQ, le 4A7C-301 a amélioré de manière significative les dysfonctionnements moteurs et non moteurs, sans effets secondaires tels que des comportements de type dyskinésie ou une inhibition de l'autophagie. Nos données démontrent la preuve de principe selon laquelle des agonistes Nurr1 optimisés peuvent fournir un traitement modificateur de la maladie pour la MP sporadique et familiale.

morpholine > piperidine, the derivative 4A7C-301 with highest fold-induction (18.12 fold) and significantly lower EC50 value (6.53 µM) than CQ (50.25 µM) was selected as a preclinical candidate for further studies (Fig. 1c; Supplementary Table 1). Brain permeability of 4A7C-301 was assessed by analysis of blood plasma and brain homogenates at different time points after oral administration in SD rats (20 mg/kg). 4A7C-301 penetrated into the brain well and was consistently maintained in the brain (Supplementary Fig. 1a–c)./p>60%) together with activation of ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba-1)-positive microglia. Pre-treatment with CQ or 4A7C-301 significantly rescued mDANs in a dose-dependent manner. 4A7C-301 showed maximal effect at 500 nM, which is a 40 times lower concentration than required for a similar CQ effect (20 µM) (Fig. 2d, e). In addition, 4A7C-301 optimally suppressed microglial activation against LPS at 500 nM, which is 40 times lower than CQ (Fig. 2f, g). To address whether CQ and 4A7C-301 can suppress the expression of pro-inflammatory genes in microglia (in the absence of mDANs), we used LPS to induce inflammation in mouse microglia-derived BV2 cells, leading to a dramatic induction of the tumor-necrosis factor-α (TNFα) gene, which was robustly suppressed by CQ and 4A7C-301 (Supplementary Fig. 6). In this assay, 4A7C-301 exhibited a much higher potency than CQ, with EC50 of ~1 and ~100 nM, respectively. Collectively, our data show that 4A7C-301 protects mDANs from MPP+- and LPS-induced cell death while suppressing neuroinflammation with a much higher potency than CQ for both effects./p> 0.05), one-way ANOVA. Data are mean ± s.e.m. n = 8 per group. g, h Immunohistochemical analyses of TH+ neurons by densitometry in the STR. Scale bar, 500 µm. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. i–k Immunohistochemical analyses of TH+ DA neurons (I, j) and NeuN+ neuros (I, k) in the SNpc. Scale bars, 500 µm.One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; j, n = 5 per group; k, n = 4 per group. Data are mean ± s.e.m. l Representative pS129 immunohistochemistry in the SNpc. Scale bars, 250 µm. m, Quantification of pS129 αSyn+ cells by counting. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. n Western blot analyses of human-αSyn in the SNpc of AAV-αSyn-injected mice. Values are expressed as a relative expression compared to contralateral side. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 3 per group. Data are mean ± s.e.m. o–q Immunohistochemical analyses of Iba-1+ microglia by counting in the STR (p) and SNpc (q). One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. Scale bars, 250 µm./p>570 derivatives of CQ and characterized them, resulting in the identification of an optimized agonist, 4A7C-301. Here, we tested 4A7C-301 and CQ for their effects on various in vitro and in vivo models of PD and propose that 4A7C-301 may provide a disease-modifying treatment for PD, as evidenced by the following results./p>20-fold), suggesting a mechanism-based Nurr1 activation. Our data revealed that 4A7C-301 effectively enhances both Nurr1’s transcriptional activator function (e.g., expression of mDAN-specific genes and production of DA in mDANs) and its repressor function (e.g., suppression of pro-inflammatory cytokine genes and microglial activation) with equally greater efficiency than CQ (>20-fold). Second, we observed that treatment with CQ or 4A7C-301 significantly restored Nurr1 protein levels that were reduced by MPP+ treatment and αSyn overexpression without change in their mRNA levels, strongly suggesting that Nurr1 ligands can regulate the levels of Nurr1 protein at the post-transcriptional levels. Thus, we speculate that Nurr1 ligands may regulate Nurr1 protein’s stability, which is vulnerable and down-regulated by environmental (MPP+) and/or genetic (αSyn) toxicity and that 4A7C-301 (and CQ to a lesser degree) exhibits neuroprotective effects by two distinct mechanisms: (1) activating Nurr1’s transcriptional function and (2) stabilizing and restoring Nurr1 protein levels. Third, using diverse cellular models, we found that 4A7C-301 substantially protects mDA cells via multiple downstream pathways such as reduction of oxidative stress and cytotoxicity, protection of mitochondrial function, induction of mDAN-specific gene expression, including GDNF-receptor c-ret, and reduction of neuroinflammation. Furthermore, while CQ inhibits autophagy, 4A7C-301 does not. In fact, 4A7C-301 restores cellular autophagy functions impaired by MPP+ treatment. Since CQ is a prototype autophagy inhibitor and known to accelerate the deposition of αSyn pathology55, CQ’s autophagy inhibition and 4A7C-301’s autophagy protection is an important distinction. We speculate that the same core structure allows CQ and 4A7C-301 to bind Nurr1 (related to the putative SAR) and show similar activities in most assays, while their different side chain structures most likely underlie their distinct effects on autophagy. In support of this, CQ and BafA1, both well-known autophagy inhibitors, significantly increased lysosomal pH, while 4A7C-301 had no effect, suggesting possible mechanisms underlying CQ/4A7C-301’s different effects on autophagy. Fourth, in MPTP- and αSyn-induced mouse models, 4A7C-301 significantly restored motor deficits and non-motor behavior (e.g., olfactory defects) without any dyskinesia-like side effects. A major limitation of current pharmacological treatments of PD is that they eventually induce side effects such as dyskinesia in many patients8,9. As expected, L-DOPA administration induced robust dyskinesia-like behavior in MPTP-induced mice. In sharp contrast, despite comparable improvements in motor tests, treatment with 4A7C-301 or CQ did not induce any detectable dyskinesia-like behavior. A possible action mechanism of 4A7C-301/CQ in the MPTP model is that they may influence metabolism of MPTP to MPP+. However, this explanation is unlikely because 4A7C-301/CQ were administered 6 h post MPTP injection, the time point when MPTP is completely metabolized into MPP+ in both the striatum and SN56./p>

50% of the observation time; 3 = display dyskinesia for the entire observation period but ceased upon external stimuli; 4 = display continuous and unceasing dyskinesia). To get a better and more sensitive validation of mice dyskinesia, we included an amplitude AIMs score, which rates the degree of deviation of body part or muscle position from its resting position on a 0-4 scale as previously described8. Finally, global AIMs score was calculated by multiplying basic AIMs and amplitude AIMs scores for each subtype on each session. Data points were plotted as the grand total of individual AIMs score on each testing day./p>